Analisis del PCR en VIH/SIDA

TEMA: Detección de anticuerpos IgA y PCR como primeras opciones en el diagnóstico de infección perinatal por el VIH-1

OBJETIVO: Evaluar la sensibilidad y especificidad de la reacción en cadena de la polimerasa y de las pruebas de ELISA e inmunoblot para anticuerpos IgA específicos, como únicos métodos en el diagnóstico de infección perinatal del VIH-1.

MUESTRA: 90 muestras de sangre de niños infectados y 153 de no infectados 

ÁCIDO NUCLEICO: ADN genómico

GEN: gag

TIPO DE PCR: Se estandarizaron ensayos de ELISA e inmunoblot y PCR 

VIZUALIZACIÓN: Electroforesis

ENZIMA: ADN Polimerasa

GEN CORTADO: SK462 que van del nucleótido 1 358 al 1 387 y SK431 que comprende del nucleótido 1 473 al 1 497 para definir una secuencia de 142 pares de bases de una región altamente conservada del gen gag.

PASOS:

La lisis celular se realizó calentando a 55 °C /45 minutos 

inactivación de la proteinasa K a 96 °C/10 minutos

La amplificación se llevó a cabo en un termociclador Perkin Elmer 2 400 bajo las siguientes condiciones: tres ciclos de 10 seg a 94 °C, 10 seg a 55 °C, 30 seg a 72 °C seguidos de 32 ciclos de 10 seg a 94 °C, 60 °C y 72 °C, respectivamente. La amplificación se completó con una extensión final de 72 °C/5 min.

RESULTADOS: La sensibilidad y especificidad de la prueba de ELISA fueron 61.1 y 90.8%, respectivamente. En el inmunoblot encontramos 82.2 y 95.4%, respectivamente, en tanto que la reacción en cadena de la polimerasa demostró tener sensibilidad de 98.3% y especificidad de 100% con sólo un falso negativo. 

Referancias:

VIH/SIDA

 Prueba de tamizaje: 

Elisa

1° Generación: primeros ensayos usaban lisados de VIH1 purificando, a menudo les faltaba sensibilidad y especificidad.
2° Generación: ensayos mejorados basados en proteínas recombinantes y/o los péptidos sintéticos que permitieron la producción combinada de VIH 1 y 2.
3° Generación: péptidos recombinantes/sintéticos de VIH 1 y VIH 2, ensayos tipo sándich, usan un antígeno marcado como conjugado, muy sensibles.
4° Generación: Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH 1 y VIH 2 y VIH 1 "O" y anticuerpos para detectar el antígeno p24,detectan tempranamente seroconversión reduciendo el período de ventana. Deben tener una sensibilidad de por lo menos el 99%.   

Confirmatoria para el VIH/SIDA

Se realizan cuando existen dos pruebas de tamizaje previas con resultado reactivos.
Confirma la presencia de anticuerpos específicos.
Escasa probabilidad de resultados falsos positivos.
La más difundida es el Western Blot.

Referencias: 

VIH/SIDA

VIH/SIDA1 

Epigenòmica del VIH-SIDA

Durante la infección por HIV se altera la modulación Th1/Th2. Existen estudios que proponen que la integración del VIH en el genoma (con la posibilidad de integrarse en regiones reguladoras) de las células puede implicar cambios epigenéticos y en consecuencia cambios en la expresión de distintos genes. Esto podría implicar alteraciones en la producción de citoquinas y en la patogénesis de la enfermedad. Además en linfocitos T CD4 con el virus latente, la transcripción del genoma viral está reprimida por des-acetilación de histonas mediado por histonas des-acetilasas. El inicio de la transcripción está mediado por el factor NF-Kb, el cual conduce a la aparición de acetil-transferasas que desplazan a las desacetilasas. Implicando, finalmente la activación de la transcripción.

Referencias: VIH-SIDA

Alteraciones de la Traducción del VIH/SIDA

Una vez generadas las cadenas de proteínas virales, otra enzima del VIH (llamada proteasa) actúa como una tijera dividiendo dichas cadenas en pequeñas proteínas individuales, que pueden cumplir varias funciones; algunas se transforman en enzimas del VIH tales como la transcriptasa inversa, mientras que otras se unen a las copias del material genético del virus, ensamblándose así nuevas partículas del VIH.
Los fármacos antirretrovirales inhibidores de la proteasa (IP) están diseñados para bloquear la división de proteínas virales e impedir así el ensamblaje de la nueva copia de VIH.

 Referencias: VIH/SIDA

 

Alteraciones de la Transcripción en el VIH/SIDA

Alteraciones de la Transcripción en el VIH/SIDA

Transcripcion inversa:  El material genético del VIH es ARN, pero para poder actuar sobre la célula, tiene que convertirlo primero en ADN. La proteína viral denominada transcriptasa inversa se encarga de convertir la cadena simple de ARN vírico en una cadena doble de ADN.

Este nuevo ADN se llamará ADN proviral o provirus que es conducido al núcleo de la célula ocupada, donde una enzima viral llamada integrasa se encarga de “incorporar” el ADN vírico dentro del propio ADN de la célula. A partir de ahora, cuando la célula produce nuevas proteínas, también produce nuevas copias del VIH.
Transcripción: Cuando la célula diana recibe una señal para volverse activa, el provirus utiliza una proteína celular llamada polimerasa para crear copias del material genético del VIH. Como el ADN no puede abandonar el núcleo de la célula, el material genético se transcribe a ARN (lo que se conoce como ARN mensajero [ARNm]), que sí pueden atravesar las paredes del núcleo celular. El ARNm sirve como patrón para la formación de cadenas largas de proteínas del VIH.

  Referencias: VIH/SIDA; VIH/SIDA1